薛妍夏天赵建斌吴少华张仲海王宗仁
摘要： 目的研究姜黄素对人肝癌细胞SMMC-7721生长的影响.方法应用MTT方法、流式细胞术及透射电镜超微结构观察来分析姜黄素对SMMC-7721细胞生长的作用及细胞周期和形态学改变.结果姜黄素明显抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞的生长，半数生长抑制剂量(IC50)为5.4 mg·L-1.流式细胞术证实，姜黄素能将肿瘤细胞聚集在S期.透射电镜超微结构观察发现姜黄素可使肿瘤细胞超微结构改变.结论姜黄素通过改变SMMC-7721细胞的周期分布和超微结构来抑制其生长.
关键词：姜黄素；肝癌；抑制作用；细胞周期
0引言
姜黄(turmeric)是姜科植物Curcuma longa li 的根茎，属活血类药，能行气滞、散风活血而止痛，有利胆、 消炎、 抗菌等作用. 姜黄素(curcumin, diferuloylmethane)是其主要成分，也是咖哩、芥末的主要黄色色素，生活中可作为调料、食品染色剂等.它的药理作用广泛，主要特性为抗炎、抗氧化和抗肿瘤，是有效的抗致突变剂和抗促癌剂［1-3］.国内外的许多研究表明姜黄素对多种体外培养的肿瘤细胞有生长抑制作用［4］，但对肝癌细胞作用的报道较少. 为此我们采用MTT法、流式细胞术及透射电镜形态观察法，探讨姜黄素对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721生长的作用.
1材料和方法
1.1材料姜黄素，中国药品生物制品检定所提供；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)，Sigma产品；RPMI-1640培养液，Gibco产品；小牛血清，杭州生物制品厂产品.人肝癌SMMC-7721细胞株由本校秦都口腔医学院引进，以4×107.L-1接种100 mL玻璃培养瓶中，在含100 mL·L-1小牛血清的RPMI-1640中贴壁生长，于50 mL·L-1 CO2，37℃培养箱中培养.
1.2方法MTT实验［5］：将对数生长的肝癌细胞SMMC-7721在50 mL·L-1，37℃培养箱内，在含100 mL·L-1小牛血清的RPMI-1640培养液中贴壁生长，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化传代，以200 μL (4×106.L-1)密度接种于96孔培养板上，孵育24 h后，倾去培养液，以姜黄素5个质量浓度(20，10，5，2.5和1.25 mg·L-1）分别加入孔内， 每一质量浓度加4孔，每孔加200μL，对照组加同量培养液，孵育48 h后，倾去药液及培养液，每孔加入MTT(5 g·L-1) 20 μL，继续孵育4 h， 倾去上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，平板振荡仪振荡10 min，以酶联免疫仪490 nm波长检测各孔吸光度(A)，按如下公式计算抑制率：
抑制率(%)=(1-(实验组A均数)/(对照组A均数))×100%
采用文献［6］的方法， 收集各处理组SMMC-7721细胞(1×109.L-1)，用冷 洗涤2次后用700 mL·L-1冷乙醇固定，4℃冰箱保存(＜7 d)待检，流式细胞仪为Coulter公司产品，Epics probile Ⅱ， 每份标本测定(2～5)×103个细胞，采用多参数细胞周期分析软件拟合处理,对样本进行细胞周期分析.
分别收集SMMC-7721细胞(1～5)×109.L-1，经洗涤，30 mL·L-1戊二醛固定细胞团60 min，10 mL·L-1还原锇酸固定60 min，梯度乙醇脱水，700 mL·L-1乙醇脱水时加醋酸双氧铀块染色，环氧树脂618浸润包埋，超薄切片，再经柠檬酸铅染色，用日本产JEM-2000FX电镜观察细胞超微结构的变化.
2结果
2.1对人肝癌细胞SMMC-7721的细胞毒作用所选姜黄素的5种浓度对人肝癌细胞SMMC-7721作用48 h后，均有不同程度的抑制作用，IC50为5.4 mg·L-1(Tab 1).
2.2姜黄素对SMMC-7721细胞周期的影响由Tab 2可见，姜黄素可以改变SMMC-7721细胞的周期分布，即G1期细胞百分率有所下降，S期细胞百分率增加，这种作用呈剂量依赖性(单次实验结果).
2.3姜黄素对SMMC-7721细胞超微结构的影响透射电镜观察显示，对照组细胞边缘有大量微绒毛，胞质内有丰富的细胞器；细胞核较大，核形不规则，异染色质较少，常染色质较多，核比较透亮，细胞增殖代谢活跃(Fig1). 姜黄素2.5 mg·L-1处理组，可见细胞膜边缘微绒毛较少，内质网、线粒体轻度肿大，胞质内出现大量溶酶体(Fig2). 姜黄素10 mg·L-1处理组，可见细胞发生明显的退变性改变，内质网、线粒体高度扩张呈空泡样，胞质内出现糖元溶解时的空白区，染色质边集、细胞核固缩(Fig3, 4).
表1姜黄素对SMMC-7721细胞的抑制作用
tab 1Inhibitory effect of curcumin on SMMC-7721 cell line(X±s)
Dose/(mg·L-1) A orbance value Inhibition rate/%
Control
0.54±0.03
0
1.25 0.41±0.03b 24.1
2.50 0.37±0.04b 31.5
5.00 0.29±0.05b 46.3
10.00 0.12±0.04b 77.8
20.00 0.05±0.02b 90.7
＜0.01 vs control.
表2姜黄素对SMMC-7721细胞周期的影响
tab 2Effect of curcumin on cell cycle of SMMC-7721
Group Cell cycle/%
G0/G1 S G2/M
Control 79.3 14.7 6.0
Curcumin(2.5 mg·L-1) 73.3 19.8 6.9
Curcumin(5.0 mg·L-1) 63.7 29.3 7.0
图1正常人肝癌细胞SMMC-7721
fig 1Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721×3000
图2姜黄素2.5 mg·L-1处理48 h后的人肝癌细胞SMMC-7721
fig 2Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 treated with 2.5 mg·L-1 curcumin for 48 h×6000
图3姜黄素10.0 mg·L-1处理48 h后的人肝癌细胞SMMC-7721
fig 3Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 treated with 1