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T细胞受体研究及其在肿瘤诊治中的应用
来源:中国癌症网     点击数:     更新时间:2007-4-20 22:15:17  
异性TCRα和TCRβ基因的有效基因转导系统。并在黑色素瘤的治疗研究中证明了体外TCR基因转导患者 L可以产生抗肿瘤CTL的可行性。将表达于大多数黑色素瘤的肿瘤相关抗原MART-1特异的HLA-A2限制性T细胞克隆的TCRαβ基因有效地转导(逆转录病毒载体)和表达到 L中,获得了识别MART-1多肽的克隆,具有特异性抗肿瘤功能的CTL株。通过SAMEN 逆转录病毒载体转导TCR基因至 MC后,也形成了具有识别EBV潜伏抗原能力的CTL,并具有抗EBV-II型恶性肿瘤活性。

由于不同个体肿瘤和白血病细胞相关抗原诱导的克隆性和优势利用的TCR Vα和TCR Vβ不尽相同,故个体化的检测和基因转导将是治疗的基本条件,当能够获得通用的独特型TCR基因序列或找到了TCR识别的某些兼并性时,才有可能在同种肿瘤中形成通用和广谱的TCR基因免疫治疗手段。

5 TCR基因删除重排及其应用

在T细胞发育过程中,TCRδ和TCRγ首先发生重排,而TCRβ和TCRα随后发生重排。在重排过程中,不被选用的其它基因片段则被删除。由于TCRδ基因位于Vα和Jα基因片段之间,TCRα基因的重排必须首先删除TCRδ基因,在删除TCRd基因时,由TCRδ基因两侧的两个删除基因片段(deleting element),称为δRec和ψJα,重组形成一环行DNA而被删除,该删除的TCRδ基因作为染色体外的环行删除产物(extrachromosomal circular excision product)仍存在于细胞中,称为T细胞受体删除DNA环(T-cell receptor excision DNA circles, TRECs)或信号结合T细胞受体删除环(Signal JointTRECs, sjTRECs, TRECs),sjTREC为游离基因,在未发生扩增时,一个初始(naïve)αβ T细胞含有两个的δRec-ψJα-sjTRECs,而随着T细胞分裂,TRECs的水平在细胞群体中逐渐被稀释,但它的数量始终代表了naïve T细胞的含量,所以通过定量检测TRECs含量,可以确定naïve T细胞数量而了解胸腺新近的输出功能。

同样,在其它TCR基因重排时,也通过形成TRECs而删除其它的基因片段,但与TCRδ基因的删除重排形成δRec-ψJα-sjTRECs有所不同,它们重排的过程更为复杂,如在TCRβ基因重排中,首先形成β-Jβ-sjTRECs,然后再形成Vβ-Dβ-sjTRECs,而且,根据所选用的Vβ、Dβ和Jβ基因片段不同,形成不同Vβ亚家族的sjTRECs,但它们可用于检测各个Vβ亚家族的naïve确T细胞的含量。

1998年Douek等在《Nature》上首次报道了该研究方法,立即引起研究人员的重视,已建立了不同年龄组健康人TRECs的范围的数据库,并将其作为HIV感染和AIDS病人治疗后胸腺功能恢复的重要评价指标。同时,也使我们加深了对一些免疫性疾病的认识,如GVHD患者TRECs水平低于无GVHD的造血干细胞移植患者,提示GVHD的存在可能影响了胸腺功能,同样也影响了移植后的免疫重建。近期也将TRECs定量分析作为评价免疫重建的新指标迅速应用于各类造血干细胞移植的研究,和对肿瘤患者胸腺输出功能的估计等等。

5.1 TRECs的检测 定量检测TRECs的方法包括实时定量PCR(real-time PCR),竞争性PCR(QC-PCR)和PCR-ELISA等方法,以实时定量PCR最为敏感和准确。

由于TCRα和TCRδ基因座的特点,分析TCRα基因重排时形成的δRec-ψJα TRECs,包含了绝大多数形成TCRα的naïve T细胞的数量,而αβT细胞占外周血T细胞95%以上,故可以了解总体上的naïve T细胞的情况。

实时定量PCR检测TRECs主要在于引物的设计,以δRec-ψJα的TRECs为例。在δRec基因片段的下游设计一下游引物和在ψJα的上游设计一上游引物,引物的方向恰好与一般的PCR引物相反,由于在δRec和ψJα的两个基因片段删除重组形成一环行DNA,其方向正好与原方向相反,只有当形成DNA环,所设计的引物才能扩增到PCR产物,这就是检测TRECs形成的方法。至于荧光素标记探针的设计和荧光实时定量PCR的方法与一般的方法相同。常用TaqMan或LightCycler等荧光定量PCR方法进行操作,在标准品的比较下,得到样本中确切TRECs的拷贝数,并根据细胞数量而计算出TRECs的水平,一般计算每103、104或105个细胞中TRECs的拷贝数(根据所检测标本中TRECs水平而定),或者以每μg DNA中所含TRECs数量作为判断胸腺输出功能的指标。至于用何种方式表示TRECs水平,则根据研究的需要而定,一般情况下,多数研究收集外周血单个核细胞( MC)的DNA进行TRECs定量,可以根据DNA的含量推算细胞含量,或应用看家基因(每个细胞含两个拷贝)的定量分析而推算检测样品中的细胞数量,然后计算TRECs水平。但如果需要确切了解T细胞中TRECs的含量,可以事先利用CD3单抗检测所检测 MC样品中,T细胞的百分数,然后进行换算,也可以首先应用免疫磁珠(MACS)和流式细胞仪分选出T细胞后,再进行TRECs的定量分析。此外,还可分选出不同的T细胞亚群如CD4 、CD8 、CD31-CD45RA 和CD31 CD45RA 等等,然后再进行TRECs含量的比较,从而确定不同细胞群中naïveT细胞的数量。

5.2 TRECs定量分析的在肿瘤研究中的意义和应用 自TRECs定量分析方法报道以来,多数的研究人员都肯定TRECs可以作为胸腺近期输出的指标,在胸腺切除术后TRECs水平显著下降,胸腺移植术后TRECs水平面明显增加以及在先天性无胸腺患者不能检测到TRECs等结果均支持了该观点。并建立了正常人TRECs水平的数据库,多个研究报道首先明确了不同年龄组健康人TRECs的范围,在新生儿中,TRECs的水平较高,在出生后5年内,TRECs水平下降明显,但在23~58岁之间TRECs水平相对稳定,80岁以上人群同样还可检测到TRECs。通过人类胸腺生成模型的分析则更为确切地提示:各亚群胸腺细胞增加的数量在出生后1年内达到高峰,随后每年约下降5%左右。胸腺近期输出CD4 和CD8 naïve细胞的水平也是在出生后1年内最高,随着年龄的增加而逐渐下降,至80岁时,每天胸腺输出功能的总量下降2个对数级以上。不同研究组所报道的不同年龄组TRECs拷贝数有所差异,以Geenen等所报道的资料较为全面,他们发现1-10岁之间,TRECs拷贝数为483±108/105细胞,11~40岁之间为354±77/105细胞,41~60岁之间为65±27/105细胞,而60~80岁以上的则为20±5/105细胞。

5.2.1 作为了解造血干细胞移植和化疗后免疫功能重建的重要指标 TRECs定量分析已被作

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