北京军事医学科学院附属医院淋巴肿瘤科 陈喜林 张伟京
【摘要】 淋巴芯片是在基因芯片技术基础上发展起来的专门用于研究恶性淋巴瘤的生物芯片。本文简要介绍了淋巴芯片的基本原理、制备的技术流程和不同类型，并着重介绍了淋巴芯片技术在恶性淋巴瘤诊断分型及探讨发病机制等应用方面取得的进展及存在的问题。
1 引言
基因芯片（Gene chip，或DNA chip，或Microarray）是近年来出现的一种高通量、快速、平行核酸序列测定及定量分析技术[1]。目前广泛应用于疾病的基因诊断、基因表达研究、基因组研究、药物筛选等领域，影响着生命科学许多领域的研究方法与途径[2～4]。而自Staudt和Alizadeh等[5]在1999年构建出第一张特殊的专门用于淋巴瘤基因表达研究的基因芯片—淋巴芯片(lymphochip)以来，淋巴芯片技术已得到迅速发展和广泛应用，已在筛选与鉴定肿瘤相关基因、探讨恶性淋巴瘤发病机制、分子诊断与分型、分析判断其生物学行为与预后、指导个体化治疗、发现与确定治疗新途径等方面逐步发挥出巨大作用，将为在21世纪攻克ML这种疾病提供一种崭新的强有力的工具。本文简要介绍了淋巴芯片的基本原理、制备的技术流程和不同类型，并着重介绍了淋巴芯片技术在研究恶性淋巴瘤发病机制、诊断分型、指导治疗和预后判断等应用方面取得的进展及存在的问题。
2 淋巴芯片的应用原理和技术特点[6，7]
淋巴芯片象其它基因芯片一样，是将大量特定序列的核酸片断（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA）有序地固定在载体上（载玻片、硅片或尼龙膜）作为探针，然后将被检测的样本DNA或者由样本mRNA转录过来的cDNA用同位素/荧光标记并与芯片上的探针杂交，通过放射自显影/激光共聚焦系统或CCD相机检测杂交信号的强弱，进而通过计算机分析判断样品中靶分子的组成及数量。大量基因片断被排列在一个很小面积的支撑物上，因此又常称为DNA微列阵(DNA microarray)。
在芯片杂交过程中，与靶序列配对良好的探针产生强杂交信号，而若有碱基错配，则信号强度减弱。而根据探针的位置和序列，可确定靶序列相应基因的表达情况、突变和多态性的存在。为减少实验误差，常在待测样本中加入标记的表达较为恒定的看家基因的cDNA作为内对照；或将不同来源的cDNA用不同颜色的荧光素标记为探针，两组探针等比例混合后，杂交到芯片上。分别扫描不同的荧光并将结果综合后加以分析，判断感兴趣组织或细胞中的基因表达差异。由于荧光标记具有实时、多色、足够的分辨率等优点，且对人体无放射性污染，所以已基本上取代了同位素标记。该技术的最大优势是可以同时分析数千种基因转录水平的改变，具有快速、高通量的特点。以基因芯片技术取代以往的原位杂交和Northern blot的优点有：①检测系统微型化，标本需求量小；②成千上万个序列的大规模基因矩阵同时检测使工作效率显著提高；③大样本基因群体化观测有利于宏观观察异常表达谱，了解基因/基因群体之间内在作用关系；④检测系统敏感性高,可鉴别丰度相差几个数量极的表达水平；④与之配套的SOM技术, 快速特化出差异位点，自动化信息分析系统取代人脑，高通量，大规模数据处理。
3 淋巴芯片技术的应用流程
淋巴芯片技术如同其它基因芯片技术一样，它的应用流程包括芯片的制备、待测样本的制备、杂交以及杂交后扫描、数据处理等环节[8、9]。
3.1 基因芯片的制备 芯片的制备方法基本分成两大类：一类是原位合成法，主要分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法两种。原位光控合成技术（光蚀刻法）是利用固相化学、光敏保护基及光刻技术在硅片上制备位置确定、高度多样性的寡核苷酸。这种方法的优点是精确性高，缺点是需要预先设计、制造一系列掩膜，因而造价高、工艺复杂，而且列阵上的序列必须是已知序列。原位标准试剂合成法的原理类似于喷墨打印，不过喷印头和墨盒有多个，墨盒中装碱基等液体，喷印头可在整个芯片上移动，并根据芯片上不同位点探针序列的需要，将合成试剂喷印在芯片的特点位置。另一类是合成后交联法。它利用手工或自动点样装置（机械手排列或光电印刷）将预先制备好的寡核苷酸或cDNA样品点在特殊处理过的玻璃片或其它材料上即可。
3.2 探针的杂交与检测 基因芯片技术实际上就是高密度集成化的反向斑点杂交技术。探针分子固定在载体上，待测基因(DNA或mRNA)经过体外转录、PCR、逆转录、末端标记等操作，成为标记有荧光染料或同位素的核酸分子，然后与固定的探针杂交。杂交条件由芯片中DNA片断的长度及芯片的用途而定，进行基因表达检测时常在高盐、低温条件下进行，需要较长的杂交时间；检测突变时常在低盐、高温条件下进行。标记核酸与固定探针的结合量取决于两种核酸分子之间碱基的匹配程度。依据标记方法的不同，通过放射自显影、激光共聚焦显微镜或CCD相机读出每个斑点信号强度，计算机对杂交信号进行处理，得到杂交谱。
4 淋巴芯片技术的应用研究进展
4.1 筛选致病基因与研究发病机制 由于基因芯片技术具有快速和高通量的特点，因此可用于从大量基因中筛选疾病相关基因，研究单个基因与基因群之间的相互关系和作用，寻找和设计新的治疗靶标等。如，Ka 等[10]用微列阵研究了霍奇金淋巴瘤(HD)950个基因的表达水平，发现HD的RS细胞分泌IL-13，而IL-13刺激RS细胞的生长。Tracey等[11]报导用基因芯片筛选并鉴别出皮肤T细胞性淋巴瘤中对TNFа耐药的多种基因。
由于基因芯片可同时检测成千上万种相关基因或感兴趣基因的表达状况和内在联系，从而大大简化基因的数量并最终找出和疾病发生转归有关的基因，从而进一步了解疾病的发生机制。美国癌症研究所(NCI)的Louis Staudt博士等[12]于1999年创建了一张分别含有淋巴细胞特异表达基因和调节淋巴细胞功能基因及在肿瘤发生中可能起作用的基因共有17,856个克隆的淋巴芯片，这种芯片能够检测出疾病特异的基因群，这种基因群仅在一种恶性疾病而不在其它疾病中表达。他们以此研究了弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的基因表达情况，并观察到DLBCL实际上含有两类不同基因表达的情况，表明这种疾病在分子水平上有不同的发病机制。淋巴芯片基因表达分析也可用于研究癌基因和抑癌基因恶性转化的分子机制。
4.2 分子诊断与基因分型 自美国麻省理工学院Whitehead研究所Golub博士领导的研究小组首次宣布，应用基因芯片技术对肿瘤进行诊断和分类，可以在基因表达水平上精确区分肿瘤的分子类型，以更好地预测肿瘤疗效以来，基因芯片技术在肿瘤的基因诊断方面取得了令人瞩目的发展。Hu on等[13]设计了一款含588个点的cDNA芯片，研究了滤泡B细胞性淋巴瘤(FL)与正常生发中心B淋巴细胞的基因表达情况，结果发现有CDK10、P120、P21CIP1、P16INK4A、Pax-5、Id-2、TNF、IL