【摘要】 目的 观察不同类型肿瘤细胞株经丝裂霉素作用后化学发光的变化，探讨化学化疗对肿瘤增殖活性的影响。方法 应用流式细胞术、化学发光测定等方法，在体外观察了丝裂霉素对两株胃肠癌肿瘤细胞的作用。结果 MMC作用24小时后肿瘤细胞化学发光强度显著降低，植物血凝素（PHA）刺激后峰值降低，峰时延缓，细胞增殖指数显著降低，凋亡比例显著增加。结论肿瘤细胞化学发光与细胞周期动力学密切相关，并能反映肿瘤细胞氧化代谢特点和增殖活性，不仅可用于观察化疗药物对肿瘤细胞代谢、增殖活性的影响，还可用于筛选敏感的化疗药物。
【关键词】 肿瘤；细胞株；化学发光；抗肿瘤药
化学发光（chemiluminescence，CL）是生物体的一种自然现象[1]，肿瘤细胞和其它生物体一样具有发光能力，通过测定发光强弱可以反映其活力。目前只有少数相关报道[2]。为了了解胃结肠癌细胞化学发光动力学及对化疗的反应，我们采用胃癌和结肠癌细胞株进行化学发光研究。现报告如下：
材料和方法
一、细胞株
BGC823为人胃癌细胞株，LoVo为人结肠癌细胞株，均购自中国科学院上海细胞生物研究所。
二、细胞培养和丝裂霉素处理
两株细胞均培养于含10%灭活小牛血清（杭州四季青生物工程研究所产品）、100U／ml青霉素、100μg／ml的RPMI-1640（美国GIBCO公司产品）培养液中。取指数生长期约1×105／ml细胞传代于培养瓶中，培养24小时后加入丝裂霉素（MMC）（日本协和发酵工业株式会社产品）100ng／ml，继续培养24小时后进行指标检测。两株细胞均分为加药组和对照组两组，对照组不加药，每组各8个样本。
三、化学发光分析
细胞用无酚红D-Hank’s液漂洗3次，细胞悬液用无酚红D-Hank’s液配成1.5×106／L。取细胞悬液0.1ml，无酚红D-Hank’s液0.7ml，1×10-3mol／L发光剂Luminol溶液（美国Sigma公司产品）0.1ml混匀置样品管中，放入SHG-1型生物化学发光测量仪（上海上立检测仪器厂产品）样品室中。待样品室温度稳定在37℃后，用T-2程序，设定测量次数为30次，间隔时间为60秒，首先测肿瘤细胞化学发光本底，然后取出样品管，逐一加入4mg／L植物血凝素（PHA）（上海市医学化验所产品）0.1ml，迅速摇匀，连续测量刺激后的发光，约30分钟。测量完毕后，在电脑上计算出各管的发光动力学曲线、峰高、峰时、斜率、积分，发光强度以每分钟闪烁频率计数（cpm）表示[3]。
四、流式细胞仪分析（FCM）
细胞用D-Hank’s液漂洗3次，显微镜下计数，将细胞浓度调整为1×106／ml。加1ml低渗碘化丙啶溶液（50μg／ml）对细胞核中的DNA染色，上机前将已经荧光染色的细胞再用40μm孔径的尼龙网过滤，结果输入Multicycle细胞周期分析软件，分析G0、G1、S、G2和M期细胞各占的百分比，计算增殖指数（PI）：
PI =×100%
DNA含量图中前端的亚二倍体峰（即凋亡小体）比例即为凋亡比例。
五、统计分析
数据均以均数±标准差表示。用 8.0统计软件进行方差分析、t检验和相关分析。
结 果
一、化学发光分析
加药组细胞化学发光峰值强度与对照组比较降低非常显著（p<0.01），而且峰值出现延缓，峰时约10～15分钟，较对照组的峰时明显延长（p<0.01）。两个细胞株的情况类似（图1、表1）。
二、流式细胞仪分析
两株细胞的细胞周期动力学变化相似。加药组与对照组相比，PI明显降低（p<0.01），凋亡比例升高非常明显（p<0.01）（表2）。
三、化学发光与细胞周期动力学的相关
CL峰值与PI变化呈正相关（BGC823：r=0.76，p<0.01；LoVo：r=0.69，p<0.01）与凋亡比例呈负相关（BGC823：r=0.86，p<0.01；LoVo：r=0.79，p<0.01），见图2～5。
讨 论
OR是细胞生化代谢的中间产物，主要由线粒体有氧呼吸和非线粒体氧耗的糖酵解产生，包括超氧化阴离子（O）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH·）、单线态氧（1O2）及次氯酸盐（OCl－），还包括细胞膜脂质过氧化产生的脂类过氧化物。OR与细胞内可激发物质反应，产生微弱的化学发光现象。测定细胞的化学发光可以了解其功能状态。
我们应用Luminol增强的化学发光法测定了人胃癌细胞株BGC823和人结肠癌细胞株LoVo的化学发光，发现两株肿瘤细胞的基础化学发光强度不高，经PHA刺激后化学发光强度逐渐上升，在4～5分钟达到最高，随后逐渐下降，此点以往国内外均未见报道。
丝裂霉素C（MMC）是一种周期非特异性抗肿瘤药，抗癌机制主要是烷化作用，使细胞中DNA解聚，抑制DNA复制，还可以引起DNA的单链断裂。MMC主要作用于G1期和早S期，但体外实验对细胞周期的影响可能因细胞种类不同而异[4-7]。
人胃癌细胞株BGC823和结肠癌细胞株LoVo与MMC共同培养24小时后，我们发现，PHA刺激后细胞化学发光峰值的产生时间显著延缓，峰值强度显著降低，增殖指数显著降低，凋亡比例显著增加，CL峰值与增殖指数变化呈正相关、与凋亡比例呈负相关；加药组两个细胞株的变化基本相同。表明癌细胞中氧自由基浓度降低，则细胞的增殖活性降低，凋亡增多，而且对PHA刺激的反应减弱，证实在低浓度范围内氧自由基浓度降低抑制肿瘤细胞分裂[8]，促进肿瘤细胞凋亡，并且提示细胞化学发光能很好地反映肿瘤细胞经化疗药作用后增殖活性的变化。
如前所述，肿瘤细胞化学发光可反映肿瘤细胞氧化代谢特点和增殖活性，可用于观察化疗药物对肿瘤细胞代谢、增殖活性的影响，筛选敏感的化疗药物。目前，应用细胞化学发光方法研究体外化疗药物对肿瘤细胞的作用尚未见报道，与其它方法相比，细胞化学发光具有灵敏、准确、快速、样品用量少、对环境污染少等优点。