时永全 翟惠虹 王 新 韩者艺 刘长江 兰 梅 杜静平

郭长存 张宇梅 吴开春 樊代明

710032 第四军医大学西京医院消化内科

目的：肿瘤细胞的多药耐药性(Multidrug resistance，MDR)是胃癌化疗失败的主要原因。胃癌细胞的MDR机制仍未完全阐明。在用差异显示PCR比较长春新碱(vincristine，VCR)诱导的胃癌MDR细胞SGC7901/VCR与其亲本细胞SGC7901基因表达差异时，我们发现核糖体蛋白(ribosomal protein，RP)S13和L23在SGC7901/VCR细胞中呈高表达。本研究的目的是探讨R 13和RPL23与胃癌细胞MDR的关系及其分子机制。方法：采用Northern blot检测R 13和RPL23在SGC7901细胞及其MDR亚系中的表达。借助反转录PCR从SGC7901/VCR细胞中扩增R 13和RPL23的编码基因，将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His，并通过基因定点突变技术使R 13/RPL23基因与V5-His标签融合。借助脂质体将融合基因转入SGC7901细胞，用His标签抗体通过Western blot鉴定融合蛋白在基因转染细胞中的表达。通过MTT实验检测胃癌细胞对化疗药物的敏感性及细胞群体倍增时间，[3H]亮氨酸掺入实验检测细胞的蛋白质合成速度，流式细胞仪检测阿霉素(adriamycin，ADR)在细胞内的蓄积和潴留，琼脂糖凝胶电泳法检测凋亡细胞的DNA梯状条带，Western blot检测P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、Bcl-2、Bax在胃癌细胞中的表达，并借助试剂盒检测胃癌细胞的谷胱苷肽S转移酶(glutathione S-tra ferase，GST)活性和谷胱苷肽含量。结果：Northern blot显示，R 13和RPL23在SGC7901/VCR细胞中的表达水平显著高于SGC7901。通过基因转染成功制备了高表达R 13或RPL23的胃癌SGC7901细胞亚系SGC7901-R 13和SGC7901-RPL23。体外药物敏感性实验显示，与SGC7901及空载体转染细胞SGC7901-pcDNA相比， SGC7901-R 13细胞对VCR、ADR、5-氟尿嘧啶的IC50值显著升高，SGC7901-RPL23对VCR、ADR、5-氟尿嘧啶、顺铂的IC50值显著升高。SGC7901、SGC7901-pcDNA、SGC7901-R 13、SGC7901-RPL23四种细胞的群体倍增时间、[3H]亮氨酸掺入率、ADR蓄积和潴留、P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白的表达无明显差异。经VCR诱导后，SGC7901和SGC7901-pcDNA细胞出现了凋亡细胞特征性的DNA梯状条带，而SGC7901-R 13和SGC7901-RPL23细胞无DNA梯状条带出现。与SGC7901和SGC7901-pcDNA细胞相比，SGC7901-R 13和SGC7901-RPL23细胞增强了Bcl-2的表达、降低了Bax的表达，SGC7901-RPL23细胞还增强了GST的活性、提高了谷胱苷肽含量。结论：R 13和RPL23的高表达可以促进胃癌细胞的MDR表型，它们介导胃癌细胞发生MDR的机制与核糖体及药物蓄积无关，而与凋亡信号的调节以及GST解毒系统有关。本研究为全面阐明胃癌MDR机制提供了有益的补充，为寻找MDR逆转剂或化疗增敏剂提供了新的靶分子和新的思路。